光声传感技术采用瞬态能量照射方式，传统上通过纳秒级光子脉冲在时域中实现。然而，高能短光子脉冲的产生依赖复杂的激光技术，这不仅导致脉冲重复频率较低，还限制了光谱成像中可同时使用的波长数量。为突破时域成像的局限性，2018 年来自慕尼黑工业大学的 Vasilis Ntziachristos 教授团队合作在《Light: Science & Applications》期刊上发表了题为“Optoacoustic microscopy at multiple discrete frequencies”的文章，文中开发了频域光声显微镜技术（FDOM），该技术将光强调制为多个离散频率。本研究将频域光声显微镜（FDOM）与多光子显微镜整合为混合成像系统，探究了成像质量与调制频率之间的关联，利用仿体和在体实验验证了调制频率数量增加时成像保真度的提升，并发现了多频率光声测量中存在的信息冗余现象。研究证实，借助高重复频率，FDOM 采用商用激光二极管即可实现与时域方法相当的信噪比。此外，通过实验验证了离散调制频率下频域成像的多项优势，包括对不同调制频率的两个波长进行同步照射，以及基于光声多普勒效应在微流控芯片和活体中实现流量测量。本文还探讨了 FDOM 如何依托频域成像的优势，重新拓展光声成像技术的应用可能性。

绝大多数光声成像技术均采用时域模式，利用脉宽为 1~100 ns 的激光脉冲实现成像。超短激光脉冲会激发产生宽带超声波，这些超声波在微秒时间尺度被采集，并用于构建光声图像。具备足够能量的纳秒光脉冲能产生强能量梯度，这是保证良好信噪比的必要条件，但此类激光技术结构复杂、成本高昂，且无法同时输出多个波长。

时域成像已成为光学相干断层扫描、核磁共振等多种成像技术开展实验研究的常用初始方案。然而，得益于频域方法的显著优势，这些成像技术的主流应用形式均已转向频域。在光声成像领域，频域成像以光强调制的连续能量流替代了时域成像所使用的光子脉冲。光强调制技术的应用实现了三方面突破：（1）提升了脉冲重复频率；（2）可在不同频率上进行信息编码（如多波长频率编码）；（3）能够采用低成本硬件设备。

但单频率频域光声成像技术无法生成高保真的组织图像，这是因为图像本身包含多个空间频率成分，不过该技术已被证实可通过双波长实现血氧饱和度检测的光谱分析潜力。基于频率线性扫频调制光的频域编码飞行时间测量技术，也已被尝试应用于单波长或双波长光声成像。在该技术中，成像检测仍在时域完成，通过对激发波和探测波进行互相关运算，提取探测超声波的飞行时间。因此，目前的光声成像技术仍基于时域信号检测（光子脉冲激发和扫频激发）或仅在频域中扫描单一频率的方案。

本研究提出了一种全新的光声成像方法，采用连续波激光并将其光强调制为多个离散频率，基于与时间无关的零差解调技术实现信号检测，并在实空间-波数空间混合域中对信号进行采样。研究人员推测，通过检测多个离散调制频率下激发的超声波的振幅和相位信息，能够全面捕捉成像目标的空间频率特征，进而获得高保真图像。为验证这一假设，研发了工作在 5~50 MHz 频率范围内的多波长频域光声显微镜（FDOM）系统，并将其与多光子显微镜整合为混合成像模态。

本研究采用的调制频率比时域光声显微镜的重复频率高两个数量级，通过测量多个调制频率下超声波的振幅和相位，实现了二维和三维光声成像。文中探究了调制频率与成像保真度的关联，对比了该技术与传统时域方法的信噪比表现，首次实现了双波长同步照射下的在体频域光声成像。同时发现，离散频率的应用使光声多普勒频移测量成为可能，进而实现了微流控流动室和活体组织微血管中的流量观测。

FDOM的激发光路与多光子显微镜共用（图 1a），两种成像模态分别工作在不同的光谱波段（图 1b）。本研究采用光强调制的连续波激光二极管，在 488 nm 和 808 nm 波长下完成 FDOM 的扫描成像（成像区域约 300×300 像素）。激光通过振镜扫描系统耦合至数值孔径为 0.45 的空气浸没物镜，实现光栅扫描（图 1a）。在每个波长下，光通量约为 0.5 mJ·cm⁻² 时，单次扫描耗时约 0.6 s。488 nm 和 808 nm 的激光波长分别加载在不同频率上，调制频率范围为 5~50 MHz，通常以 5 MHz 为步长调节（图 1c），实现了频域方法特有的多色光同步照射。

采用中心频率 75 MHz、-12 dB 带宽 117 MHz 的球聚焦压电换能器检测光声信号。在透射模式下，换能器与照明物镜的焦点对准，并处于离焦位置，以覆盖整个扫描区域。换能器前端装配 3 mm 厚的玻璃透镜，实现声聚焦。通过基于零差的正交解调技术，实时解析产生的光声信号的振幅和相位，并利用模数转换器完成信号采集。

共定位多光子显微镜采用 1043 nm 飞秒激光作为激发光源，通过二向色镜将其耦合至 FDOM 的光路中，并经由同一物镜实现照明（图 1a）。二次谐波和双光子激发荧光信号通过二向色镜后，由光电倍增管在背向进行探测；三次谐波信号则在透射方向由替代换能器的另一台光电倍增管记录。

为明确频域光声成像的形成特征，在水中对一对交叉的直径 50 μm 缝合线仿体进行成像（图 2a ），分别在 488 nm（图 2b）和 808 nm（未展示）波长下采用不同离散调制频率完成扫描。不同调制频率能够激发并捕捉不同的空间频率成分（等效于波数空间采样，成像原理详见图 2b、c）。图 2b 中每个子图为单一调制频率下的目标成像结果，彩色图像叠加了各调制频率的贡献，展示了不同调制频率携带的图像信息。

将单一激发频率下的空间振幅信息叠加，可在单张融合图像中实现多个空间频率的叠加，这表明不同频率能够捕捉图像中的互补信息，相比单一调制频率成像，有效提升了成像质量（图 2b）。为验证该技术能否从比缝合线更复杂的结构中提取空间频率信息，采用 9 个调制频率（以 5 MHz 为步长，覆盖 10~50 MHz），对 5 日龄野生型斑马鱼幼鱼的眼睛进行离体成像。

成像中可清晰观察到条纹结构，且条纹的形态随调制频率波段的变化而改变（图 2d）。不同频率下成像结果的彩色叠加显示，各波段条纹存在互补性（图 2d-f），相比单一频率波段，能更真实地还原样品结构。对 8 日龄转基因 Casper 型斑马鱼胚胎进行离体混合频域光声-双光子激发荧光成像，该胚胎的神经系统表达绿色荧光蛋白，成像结果证实了光声和多光子成像系统具备天然的图像配准能力。

作为关键后续研究，作者利用嵌入散射琼脂中的直径 40 μm 黑色缝合线仿体，对比了 FDOM 与传统时域光声成像的信噪比。FDOM 的实验条件为：488 nm 波长，样品处光通量约 100 W·cm⁻²，9 个调制频率（10~50 MHz）（图 2g、h）；时域成像采用 532 nm 二极管泵浦固体激光器，脉宽 1.4 ns，样品处脉冲能量约 10 nJ，为传统时域光声显微镜的典型实验参数。频域和时域成像使用同一超声换能器。

在假设频域和时域成像采集时间相同的条件下，FDOM 成像的信噪比约为 35 dB，时域显微镜成像的信噪比约为 29 dB（图 2g、h），这一结果与理论信噪比计算值一致。上述结果基于以下实验设置得出：时域单次测量的重复频率为 20 kHz，频域则以 240 kS·s⁻¹ 的速率完成 100 次平均采样。研究证实，凭借超高的重复频率，FDOM 可实现与时域光声显微镜相当的信噪比。

优势在于，时域系统的扫描速度同时受信噪比和超声波从目标到探测器的飞行时间限制，而 FDOM 的时间分辨率主要由信噪比决定。当然，信噪比结果会随实验中激光能量、功率以及时域和频域数据采集硬件的探测带宽变化而改变。本研究使用的 FDOM 采样率为 240 kS·s⁻¹，并非最优参数，通过采用更高端的探测系统可进一步提升采样速度。因此，本研究的测量结果可作为参考，为不同照射条件下时域和频域光声成像的信噪比关联计算提供依据。

通过对麻醉裸鼠的耳部进行成像，验证了 FDOM 的在体组织成像能力。实验采用 9 个调制频率（以 5 MHz 为步长，覆盖 10~50 MHz），在 488 nm 波长下完成成像，所有激光功率均远低于美国国家标准学会规定的安全标准。成像视场为 360×360 μm²，扫描步长 1.2 μm，相邻视场拼接后总成像面积为 960×960 μm²，可分辨直径 4 μm（毛细血管）至 33 μm 的微血管结构（图 3a）。

对图 3a 中虚线框区域进行单一调制频率重建成像（图 3b-d），发现调制频率与图像中光吸收体尺寸存在关联，这与图 2b 的研究结果一致。研究发现，单一频率成像仅能捕捉成像目标的部分特征，无法重建包含目标所有结构的高保真图像。具体而言，50 MHz 成像可清晰显示微血管等微观细节（图 3d），而 10 和 30 MHz 成像则无法实现（图 3b、c）；通过图像的线轮廓分析可见，与 50 MHz 成像相比，10 和 30 MHz 成像中较大血管的形态更均匀（图 3f）。

该测量结果进一步揭示了目标的空间频率与光调制频率之间的关联，表明需要采用与成像目标空间频率匹配的多个调制频率，才能获得无伪影的图像。正如预期，成像信噪比随调制频率数量增加而提升，从单一频率的约 14 dB 提升至 9 个频率的约 30 dB（图 3e）。由于 8 个和 9 个频率之间的信噪比仅提升约 2 dB，本研究未进一步探索更多频率的应用，这一实验结果也从实际层面验证了此前光声振幅和相位测量数值模拟研究的结论。

随后，对注射 B16F10 小鼠转移性黑色素瘤细胞的小鼠耳部进行双波长（488 nm 和 808 nm）同步激发的在体成像，这一技术在时域光声成像中无法实现。488 nm 波长对血管具有高敏感性，原因是血红蛋白在该波长下具有强吸收特性；而所采用的 B16F10 细胞系对近红外波长响应显著。由于黑色素的光吸收光谱平坦，FDOM 在 488 nm 和 808 nm 波长下均能清晰显示 B16F10 细胞，而血红蛋白在近红外光下吸收较弱，因此血管在 808 nm 波长下几乎不可见。两个波长在傅里叶空间中相互分离。

配准后的二次谐波、三次谐波和双波长 FDOM 呈现出优异的无标记对比度（图 3g-l），能够实现不同组织特征的区分：488 nm 频域光声成像显示血管结构（图 3i）；488 和 808 nm 频域光声成像显示黑色素瘤细胞（图 3i、j）；约 522 nm 的二次谐波成像显示表皮胶原分布（图 3k）；约 348 nm 的三次谐波成像显示组织形态，主要为角质形成细胞和毛囊（图 3l）。相邻视场拼接后的总成像视场为 1220×1220 μm²，FDOM 的像素尺寸约 2 μm，多光子成像模态的像素尺寸 0.8 μm（图 3g）。明场显微镜成像验证了混合成像的结果（图 3h）。

本文提出的频域光声成像技术具有一项独特优势：利用离散调制频率，可基于光声多普勒效应直接实现流量检测，而时域光声系统需通过基于时间相关的间接方法完成测量。本研究首次通过实验验证了该技术在活体中的应用可行性，将超声探测器与成像平面呈约 55° 夹角放置，实现频域微多普勒测量（图 4a）。

作为初步验证实验，利用注射泵驱动直径 2~12 μm 的炭黑颗粒，在横截面为 1 mm × 200 μm 的微流控芯片中以不同流速循环流动。采用 15 MHz的调制频率，对 0.1~2 mm·s⁻¹ 的流速进行 10 次连续测量。0、0.3 和 1.3 mm·s⁻¹ 流速下的平均频谱（图 4b-d）均出现一个中心峰（fmod），对应所采用的调制频率，由静止目标产生，且频谱宽度随流速增加而扩大。1.3 mm·s⁻¹ 的流速产生 7 Hz 的多普勒频移（ΔfH），0.3 mm·s⁻¹ 的流速产生 2 Hz 的多普勒频移（ΔfL）。

频谱展宽主要由两个因素导致：一是球聚焦换能器的尺寸有限，其有效探测面上不同角度的多普勒频移会被平均；二是流动的吸收体在通道中以不同流速运动。当颗粒向远离换能器的方向流动时，观测到的频谱向低于 fmod 的方向偏移（红移）；当颗粒向靠近换能器的方向流动时，频谱向高于 fmod 的方向偏移（蓝移）。多普勒频移平均值随流速的变化呈线性趋势（R²=0.996，图 4e），该曲线被用作小鼠耳部 μDoppler FDOM 在体实验的校准曲线。通过实验测得多普勒角为 58±1°，与微多普勒实验中设定的约 55° 换能器夹角高度吻合。本研究中所有多普勒流量实验的每个扫描位置的积分时间约为 8 秒。

随后，利用频域微多普勒光声显微镜 μDoppler 实现了小鼠耳部微循环血流的分布图绘制和流量轮廓测量。实验中，首先在与图 3a 相同的条件下，对小鼠耳部 160×160 μm² 的区域进行扫描，获得高分辨率形态学图像（图 4f）；随后在同一感兴趣区域，采用 42 MHz 调制频率进行约 55 分钟的多普勒扫描，生成多普勒频移流量图（图 4g）。图像叠加和融合结果证实，多普勒扫描与小鼠耳部的光声成像具有空间一致性，彩色编码进一步显示了相对于换能器的血流方向（图 4h、i）。

对叠加图像的流量分析结果（图 4j）以白色箭头标注，结果表明，在形态学图像中看似属于同一血管结构的区域，经彩色编码流量分析后，实际为不同的血管结构。对图 4g 中白色箭头标注的毛细血管进行 2 μm 步长的横截面流量轮廓分析，发现流速从血管边缘向血管中心逐渐增加（图 4k）。对多普勒频移值进行抛物线拟合（R²=0.997），得出最大血流速度约为 0.44 mm·s⁻¹。

然后，使用 μDoppler FDOM 生成小鼠耳朵微循环血流的血流图和血流剖面。在这些实验中，在160×160 μm² 的耳朵区域在与图 3a 相同的条件下扫描，以获得高分辨率形态学图像（图4f）。接下来，在同一感兴趣区域在约 55 分钟内以 42 MHz 进行多普勒扫描，从而生成多普勒频移血流图（图4g）。叠加和混合证实了多普勒扫描与小鼠耳朵光声图像之间的空间一致性。颜色编码进一步展示了相对于换能器的流动方向，如图 4h,i 所示。叠加图像（图 4j）的流分析结果用白色箭头标记，证明在形态学图像（图 4f）中明显属于同一血管结构的血管实际上代表不同的血管结构，如颜色编码流分析所揭示的。

在图 4g 中白色箭头突出显示的毛细血管上，以 2 μm 步长进行横截面流剖面分析，显示从血管边缘到核心的流速逐渐增加（图 4k）。对多普勒频移值的抛物线拟合（R²=0.997）表明最大流速约为 0.44 mm·s⁻¹。

从电信、雷达技术到核磁共振成像系统，频域方法相对时域方法的主要优势已在众多领域得到验证。本研究首次提出采用低成本连续波激光二极管照射，实现多离散频率的频域光声成像，并探索了该技术在活体显微镜中的应用价值。在低频兆赫范围内对激光光强进行扫频调制，可实现深度剖面成像。本研究发现，采用多个调制频率是实现高成像保真度的关键，即使使用聚焦激光束，也能精准捕捉各种空间频率成分。研究表明，调制频率数量越多，越能充分捕捉图像特征，但当频率数量超过 8 个时，成像质量的提升趋于平缓，这与此前的数值模拟研究结果一致。该发现意味着，传统基于宽带激发的时域光声成像方法存在显著的频率过采样现象，证实了信息采集过程中存在冗余。

时域光谱光声成像的发展受限于超快脉冲光源，可调谐脉冲激光器（包括染料激光器和光参量振荡器）依赖调 Q 泵浦源，成本高昂且一次仅能输出一个波长；单波长脉冲激光器成本较低，可组合使用以实现近同步的多波长照射，但目前可用的可见光和近红外波长数量有限，仅有发射 1064 nm 激光的 Nd:YAG 激光器及其倍频后的 532 nm 激光器实现商用。本研究证实，采用连续波激光器进行光源调制，可拓展可用波长范围，且依托频域技术的独特优势，可对不同波长进行频率编码，实现多波长同步照射。FDOM 具有高重复频率的特点，能激发产生窄带光声信号，因此可采用简易的模数转换器，实现低成本、低噪声的零差检测。

光声显微镜与光学显微镜的结合，实现了多种组织特征的无标记可视化，弥补了传统基于荧光对比度成像的不足，为生物检测提供了多参数分析手段。将 FDOM 与多种多光子成像模态整合于同一系统，可在配准图像中同时观察微米级血管、黑色素瘤细胞、胶原和角质形成细胞等软组织结构。

时域流量传感方法为间接测量，主要依赖基于相关分析的手段，而 FDOM 利用离散频率的优势，首次通过锁相检测实现了基于光声多普勒效应的微循环血流在体测量。此前，光声多普勒效应仅被用于仿体中微米级颗粒的流量追踪。频域多普勒测量有望成为时域光声无标记血流测量的更快速、更稳健的替代方案，原因在于：时域流量测量需通过互相关技术，对每个扫描位置采集的信号进行序贯分析，该过程无法实时完成，且需要大量的计算时间和存储资源；此外，时域血流定量测量还需掌握血管内光学焦点的尺寸信息。

综上，FDOM 首次实现了与时间无关的光声信号检测和解调，能够捕捉成像目标多个空间频率下的振幅和相位信号。该技术充分发挥了频域方法的优势，包括可采用波长范围广的低成本光源、基于解调的信号检测、多波长同步照射以及基于多普勒效应的直接流量测量。为进一步提升系统性能，计划开展多项改进工作，例如采用同步频率调制以支持实时应用。未来，该成像系统的研究将聚焦于调制频率和成像深度的定量评估，以及成像分辨率的提升。

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